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Polymerase Chain Reaction…. DAFUQ?

Im Moment ist der PCR-Test die Grundlage für Pandemiemaßnahmen und wird entsprechend von Querdenkern wie Samuel Eckert angefeindet. Wir erklären knapp, was PCR überhaupt ist.

Gestern haben wir gelesen, dass sich im beschaulichen Fehraltorf heute ein virenleugnender Molekularbiologe gemeinsam mit schwurbelnden Rechtsanwälten und einem antisemitischem Laienprediger in einer geselligen Männerrunde ein Stelldichein zum Thema PCR geben werden. Entsprechend Samuel Eckerts Ankündigungen dürfen wir in ihrem Kreuzzug gegen die PCR-Tests bald mit neuen Schritten rechnen.

Bevor also alte weiße Männer in den kommenden Tagen Ihre hanebüchenen Halbweisheiten in die Welt posaunen, erklären wir im Folgenden die Grundlagen der nobelpreisgekrönten PCR-Technologie.

Wir sind es ja schon viele Jahre gewohnt, dass uns mittelalte Männer ungefragt die Welt erklären. Es ist also gar nicht verwunderlich, dass diese Riege nicht einmal vor den klassischen Methoden der Molekularbiologie halt macht.

Bereits beim Thema der Koch’schen Postulate haben wir gesehen, dass man bei den Galleonsfiguren der Corona-Leugner eher auf interessierte Laien als auf Sachverständige trifft, deren Meinungen häufig diametral zum wissenschaftlichen Konsens läuft. Oder auf Leute, seit ihrer mit Ach und Krach geschafften Promotion kaum mehr wissenschaftlich gearbeitet haben und in Richtung „Neue Germanische Medizin“ abdriften. Wie Lanka.

Hier also einmal ein paar Grundlagen zum Thema PCR. Dabei konzentrieren wir uns auf die Grundlagen der Technik und der Laborroutine. Eine Diskussion über die richtige Teststrategie sowie über die korrekte Anwendung der verschiedenen Tests und ihre Auswertung überlassen wir an dieser Stelle lieber den dazu ausgebildeten Spezialisten, nämlich Zertifizierungsstellen, Laborklinikern und Epidemiologen.

Also, wat is en PCR? Da stelle mehr uns janz dumm. Jorge B, Andreas J, Naomi S, Samuel L & Co haben hier zunächst nämlich einen kleinen Vorteil. Aber der geneigte Leser macht diesen im Nu mit etwas Aufmerksamkeit wett 🙂 .

Wohl an!

Mit der PCR können Fragmente von Ergbut, also Nukleinsäuren (DNA oder RNA) vervielfältigt werden. Das ist notwendig, um im einfachsten Fall das Vorhandensein bestimmter DNA-Abschnitte zu überprüfen (wie zum Beispiel die Anwesenheit bestimmter Erreger). Häufig werden im Labor aber auch Sequenzabschnitte zur weiteren Verarbeitung wie zum Beispiel zur Sequenzbestimmung (Sequenzierung) oder Klonierung (yeah, whatever) via PCR amplifiziert.

Wie diese Vervielfältigung passiert, steckt bereits im Namen: PCR steht für Polymerase Kettenreaktion (engl.: Polymerase Chain Reaction).

Um die Brillianz hinter der Kettenreaktion zu verstehen, schauen wir uns zuerst an, was es mit DNA auf sich hat.

Die DNA besteht aus einem sogenannten Doppelstrang. Dieser Doppelstrang besteht – man glaubt es kaum – aus zwei Einzelsträngen. Innerhalb eines jeden Einzelstrangs reihen sich über feste Elektronenbindungen die sogenannten Nukleotide (oder auch „Basen“) aneinander und codieren in ihrer Abfolge Gene und regulatorische Abschnitte. Der Einfachheit halber beschränken wir uns auf die 4 grundlegenende Nukleotide Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin, kurz: A, G, C, T.

Für die Filmfans: Habt Ihr Euch über den seltsamen Namen des Spiefilms „GATTACA“ mit Ethan Hawke von 1997 gewundert? Der basiert auf einer im menschlichen Erbgut häufig vorkommenen Abfolge ebenjener Nukleotide. Wir kennen diese Nukleotide also schon etwas länger.

Diese molekularen Bausteine unserer zellulären Blaupausen haben unter anderem die phänomenale Eigenschaft, neben festen Verknüpfungen auch flüchtige Bindungen, sogenannte Wasserstoffbrücken auszubilden. Das machen sie aber nicht irgendwie. Die energetisch günstigsten Brücken bilden sich zwischen den Paaren A & T (2 Wasserstoffbrücken) sowie G & C (3 Wasserstoffbrücken).

Diese Wasserstoffbrücken sind flüchtig, und damit instabil. Hat man jedoch 2 längere Sequenzabschnitte von einander komplementärer Sequenz vorliegen, so legen sich diese beiden Einzelstränge reißverschlußartig übereinander und bilden über die Summe vieler schwacher Wasserstoffbrücken einen stabilen Doppelstrang.

Das hat für Mutter Natur unter anderem den Vorteil, dass eine Sequenzinformation immer doppelt vorliegt: einmal im Strang und einmal im komplementären Gegenstrang. Diese Redundanz ist eine wichtige Grundlage in der Reparaturstrategie von DNA-Schäden.

Nun aber weiter zur PCR.

Ich habe einen Doppelstrang DNA mit zumindest teilweise bekannter Sequenz, den ich vervielfältigen möchte. Diesen nennt man Template (= Vorlage). Da die Bindungen zwischen den beiden Einzelsträngen nicht starr sind, kann ich diese durch Zuführen von Energie lösen.

Im Labor geschieht dies durch vorsichtiges Erhitzen der Probe, das sogenannte „Schmelzen“. Dabei lösen sich die flüchtigen Wasserstoffbrücken nach und nach, so dass ab einer bestimmten Temperatur nur noch Einzelstränge im Reaktionsgemisch vorliegen. Kühle ich die Probe langsam ab, so finden sich diese Einzelstränge wieder zu Doppelsträngen zusammen.

Namensgebend weil wesentlich für die Kettenreaktion ist ein Enzym: die sogenannte Polymerase. Dieses ist in der Lage, durch Entlanggleiten auf einem DNA-Einzelstrang diesen Abzulesen und durch stückweises Verknüpfen einzelner frei herumschwimmender Basen einen komplementären DNA-Doppelstrang aufzufüllen. Das macht die Polymerase aber nicht einfach so. Sie benötigt für den Start immer ein kleines Stück Doppelstrang-DNA.

Dieses interessante Verhalten macht man sich im Labor zu nutze, um den Startpunkt der Polymerase und damit der Kettenreaktion genau festzulegen. Hierfür verwendet man kurze DNA-Fragmente, sogenannte Primer (engl: to prime – vorbereiten, fertig machen). Diese Primer sind kleine Kunstwerke, denn sie werden für die jeweilig beabsichtigte Reaktion im Computer designt, im Labor synthetisiert um dann in der PCR getestet & verwendet zu werden. Im Design der Primer steckt viel Know-How, da diese bestimmte Kriterien erfüllen müssen. 

Kurz zusammengefasst sind dies u.a.:

  • ein Primer darf nur einmal im eingesetzten DNA-Template binden
  • ein Primer muss bei einer bestimmten Reaktionstemperatur an die Einzelstrang DNA binden
    Es gibt zahlreiche Algorithmen, Primer vorab zu prüfen und zu berechnen. Einen Überblick bietet: 
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Wir werfen also einen Primer zusammen mit der Ziel-DNA (Template) sowie einer Polymerase in ein Reagenzgefäß. Beim Erhitzen schmilzt der Doppelstrang der Template-DNA zum Einzelstrang. Kühle ich das Reaktionsgemisch langsam ab, legen sich die Doppelstränge wieder zusammen. Hier und da passiert es im Gemisch aber, dass einer meiner Primer auf der Ziel-DNA bindet (Annealing). In der Folge findet das besagte Polymerase-Enzym eine Plattform zum Andocken und beginnt den Strang dahinter zum Doppelstrang entsprechend des Templates aufzufüllen.

HEUREKA – Ich habe meine erste Vervielfachung von Template DNA erreicht!

Im ersten Schritt ist dies noch so wenig, dass es kaum messbar ist. Darum kommt hier der nächste Trick: Statt 1 Primer verwende ich zwei Primer (also 1 Primerpaar), welche in einigem Abstand zueinander ihr Ziel auf der Template-DNA finden.

Beim Design des Primerpärchens liegen die Sequenzen so, dass Primer 1 auf einem Strang und Primer 2 auf dem Gegenstrang der DNA bindet. Läuft die Polymerase von jeder der beiden Primer-Template-Plattformen los, so synthetisiert sie die Template DNA von Strang bzw. Gegenstrang inklusive der Bindestelle des jeweils anderen Primers.

Erhitze ich nach dem ersten Durchgang das Reaktionsgemisch, so dient die neusynthetisierte DNA aus dem ersten Durchgang gleichfalls als Template und Primerbindungsstelle. Wiederhole ich die Schritte

  1. Schmelzen
  2. Primerbindung
  3. Polymerasereaktion

mehrmals zyklusartig, so verzeichne ich mit jedem Schritt eine Verdopplung der Template-DNA.

Ich habe eine Kettenreaktion \o/

Schwirrt der Kopf? Das ist okay – lasst es kurz sacken und vollzieht das z.B. auf jener Abbildung nach:

Von: https://www.genome.gov/sites/default/files/tg/en/illustration/polymerase_chain_reaction.jpg; Klick auf die Grafik vergrößert sie.

Dass das verwendete Polymerase-Enzym nebenher temperaturstabil und die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches mit allen benötigten Bestandteilen gut ausgewogen sein muss, das ist dann fast schon nebensächlich – brachte Mullis & Smith 1993 aber immerhin den Nobelpreis für Chemie ein.

Wie immer kann man solche Reaktionen nicht ewig treiben – muss man aber auch gar nicht. In der Regel werden im Labor 30-40 Zyklen bei einer PCR durchgeführt. Hiernach ist der Reaktionsmix verbraucht und die freien Nukleotide sind im besten Fall im Produkt verbaut. Betrachtet man die Zunahme an neu gebildeter DNA in einem Diagram aus DNA-Gehalt und Zykluszahl, gibt es eine Kurve mit sigmoidalem Verlauf: es beginnt langsam, weil sich Template und Primer finden müssen; es folgt ein linearer Anstieg bei Verdopplung der DNA und eine Sättigung, wenn sich die Ausgangsstoffe und Enzymaktivitäten langsam reduzieren.

Woher weiß ich aber, das meine PCR funktioniert hat?!

Man ahnt es – der Wissenschaftler überlässt die Aussage seiner PCR natürlich nicht (!) dem Zufall.

Da ich dank der vorausgegangenen Sequenzchecks weiß, welche Länge mein Produktfragment haben muss und ggf. auch die Sequenz kenne, kann ich beides im Zuge der Etablierung einer PCR überprüfen. In einigen Verfahren kann am Ende der PCR-Zyklen auch noch eine sogenannte Schmelzkurve aufgenommen werden. Hierbei wird in kleinen schritten die Temperatur erhöht und dabei verfolgt, wann sich alle DNA Doppelstränge in Einzelstränge aufgelöst haben. Da der Schmelzpunkt eines Produkts stark von dessen Sequenz abhängt, ist das Ergebnis dieser Schmelzkurve ein produktspezifisches Bild, anhand dessen ich schon die Qualität eines PCR-Laufes beurteilen kann.

Es ist selten, dass im Labor etwas auf Anhieb klappt. Darum werden im Zuge der Etablierung einer PCR häufig mehrere Primerpaare parallel getestet und die Reaktion im Anschluss auf verschiedene Qualitätskriterien hin untersucht.

Inzwischen gibt es viele verschiedene Spielarten der PCR. 

  • Man kann die Sequenz der Template-DNA entschlüsseln.
  • Man kann gezielte Mutationen einbringen.
  • Man kann statt DNA in der RT-PCR auch die chemisch etwas anders geartete RNA als Template verwenden. Hierbei wird in einem ersten Schritt die RNA in DNA umgeschrieben (reverse Transkription = RT).
  • Man kann in der qPCR unter Verwendung von bestimmten Kontrollen die Menge von Template-DNA quantifizieren.
  • Man kann in Echtzeit die Menge von RNA bestimmen (Real-Time qRT-PCR).

So weit, so Routine. 

Wie das im Labor aussieht, fasst ein Video der Uniklinik RWTH Aachen kurz & bündig zusammen:

Gern würden wir an dieser Stelle im Stile von Ronald Pofalla die Diskussion um PCR & Tests für beendet erklären.

Da die PCR aber ihre Limitationen hat und in eine erfolgreiche Teststrategie viele Parameter einfließen, machen wir nicht den Fehler wie unsere liebsten Corona-Leugner und mansplainen nun auch noch über PPV, NPV.

Stattdessen ordnen wir für Euch lieber die gängisten Kritikpunkte ein.

  1. „Das ist nur ein Alignment!“

    Nein, das Alignment – sprich: die Zusammenstellung einer durchgängigen Sequenzinformation – passierte schon vorher und ist in Sequenzdatenbanken hinterlegt. Diese Datenbanken nutzt man aber, um die richtigen Bindestellen für seine Primerpaare zu identifizieren.

    Das, was ich am Ende einer PCR aus dem Reagenzgefäß erhalte und evt. sogar aufreinigen kann, ist real vorliegende DNA, die ich fragmentweise zB aus einem Virus erhalten kann.

    An all die Corona-Autoren, die sich nun zu einem neuen PCR-Pamphlet berufen fühlen: bitte lasst es und bildet Euch erst einmal weiter. Ein solider Startpunkt findet sich zum Beispiel hier https://d-nb.info/956820425/04

  2. „Selbst der Erfinder, der PCR sagt, die Methode sei nicht zum Nachweis geeignet!“

    Auch wenn Naomi, Andreas & Co diesen Facebook-Kommentar noch so oft nachquatschen – er wird dadurch nicht wahr.

    Würden sie wenigstens die Quellen lesen, die sie anführen, so würden sie dort folgendes Zitat lesen:

    „Quantitative PCR is an oxymoron. Translation: the PCR test can’t be used to say how much virus is in a person’s body.“

    Heißt übersetzt: Miller sagt nicht, dass die PCR für die Detektion von Virus ungeeignet sei – er warnt lediglich vor Aussagen über die Virusmenge in einem Patienten. Dies ist nicht in erster Linie der PCR geschuldet. Vielmehr gibt es vom Patientenabstrich bis zum fertigen Ergebnis einfach zu viele Unwägbarkeiten in der Probenhandhabung. Unter den geeigneten Bedingungen kann mittels PCR (genauer qPCR oder qRT-PCR) auch für quantitative Aussagen genutzt werden.

  3. „Der Test ist gar nicht für Sars-Cov-2 spezifisch“

    Nun ist es für uns unmöglich, alle gängigen PCR-Tests zu untersuchen. Doch gehen wir einfach mal davon aus, dass eine Firma, die mit PCR ihr Geld verdienen möchte, weiß, wie man spezifische Primerpaare designt.

    Exemplarisch erklären wir das aber gern einmal am Test von Christian Drosten. Das Protokoll zum ersten Test ist nicht nur frei zugänglich – nein, mit etwas Fachverstand findet sich sogar die Antwort auf eben jene Frage…wenn man sie denn verstehen möchte.

    Darin findet sich folgender Satz:
    „we formulated the RdRp assay so that it contains two probes: a broad-range probe reacting with SARS-CoV and 2019-nCoV and an additional probe that reacts only with 2019-nCoV. […] The specific probe RdRP_SARSr-P2 detected only the 2019-nCoV RNA transcript but not the SARS-CoV RNA“

    Übersetzt bedeutet dies, dass im vorliegenden Test nicht einfach nur irgendein Virusabschnitt getestet wird. Vielmehr werden zwei molekulare Sonden parallel verwendet:

    – Sonde #1 testet auf Vorliegen von RNA aus der Familie der Corona-Viren und
    – Sonde #2 testet spezifisch auf einen Bereich im SARS-CoV-2.

  4. „Die sind alle falsch positiv!“

    Seinen kometenhaften Aufstieg am Schwurbelfirmament dürfte Samuel Eckert nicht zuletzt einem Video verdanken, in dem er in gewohnt stakkatoartiger Weise versucht zu erklären, dass der PCR-Test massenhaft falsch-positive Werte ausgeben würde.

    Hintergrund dieser These ist der Umstand, des jeder Test neben korrekten Ergebnissen auch falsch-positive und falsch-negative Proben ausgeben kann.

    Das ist angesichts millionenfach durchzuführender Tests natürlich ein wichtiger Punkt!

    Entgegen Samuels aufgeregter Art ist dieses Phänomen für jeden Laborkliniker aber keine Neuigkeit. Unterm Strich erklärt unser Laienprediger nur sehr ausführlich, warum ein verdachtsunabhängiges Testen ohne jegliches Symptom eher kontraproduktiv ist und ist damit voll auf Linie mit den Empfehlungen des RKIs 😉

    „[…] Eine Testung ist indiziert, wenn aufgrund von Anamnese, Symptomen oder Befunden ein klinischer Verdacht besteht, der mit einer SARS-CoV-2 Infektion (COVID-19) vereinbar ist […]“
    https://www.rki.de/DE/Content/InfAZ/N/Neuartiges_Coronavirus/Vorl_Testung_nCoV.html#doc13490982bodyText4

    Warum nur symptomatisch auffälliger Personen getestet werden sollten, wird hier (in englisch) in diesem Video auch noch einmal vorgerechnet: https://youtu.be/QqgJHryKOSU

  5. „Aber der Threshold!!!“

    Ja, was ist denn mit dem Threshold, lieber Jorge?
    Für eine Ja/Nein-Aussage ist der Threshold, respektive der Zyklus Ct, in dem die neu syntethisierte DNA einen bestimmte Grenzwert (engl.: Threshold) übersteigt wenig relevant.

    Wirklich wichtig, wird das erst, wenn wir Viruslast bestimmen wollen würden – machen wir ja aus oben genannten Gründen gar nicht. Kurvenverlauf und Schmelzpunkt sind hier die viel wichtigeren Qualitätskriterien, um die Bildung eines spezifischen Produktes von etwaigen Nebenprodukten und Primer-Dimeren zu unterscheiden.

  6. „Die PCR weist gar keine Viren nach – das sind gar keine Infektionen!“

    Ja und nein.
    In der Tat ist es richtig, dass mittels PCR im Grunde nur das Vorhandensein von DNA bzw. RNA nachgewiesen wird.

    Ob diese DNA nun von einer Türklinke mit eingetrocknetem Virus oder einem Rachenabstrich stammt ist dem Testergebnis nicht zu entnehmen.

    Aber jetzt denken wir einmal ganz scharf nach: wir weisen bei einer Person ein infektiöses Virus, für das alle Koch’schen Postulate erfüllt sind in dessen natürlichen Habitat (u.a. Schleimhäute) in nachweisbaren Mengen mit zwei unterschiedlichen PCR-Sonden nach.

    Was wird wohl wahrscheinlicher sein:

    a) ich habe mit dem Finger SARS-CoV-2-RNA von der Türklinke aufgelesen und diese beim Popeln aus versehen bis in den Rachen geschoben

    oder

    b) ich habe mich infiziert?

Fazit:

Egal ob bei Frauen oder der PCR – immer reißen die mit dem gefährlichen Halbwissen zum Zyklus die Klappe am weitesten auf.

7 Antworten auf „Polymerase Chain Reaction…. DAFUQ?“

Vielen Dank für diesen Artikel, ich glaube, ein oder zwei Stellen wollen ausgedruckt und im Labor für die Studis an die PCR-Hoods und unseren StepOne geklebt werden. 🙂

So ein lächerlicher Käse, immer wieder interessant die Versuche hier, gegen Querdenker zu hetzen.

Und die Borderline Zecke weiß es natürlich alles viel besser, als Professoren, Beipackzettel (nicht zu Diagnosezwecken geeignet), ist klar. Und einen Beleg braucht die Zecke dafür natürlich auch nicht.

Tja, warum sollte man wohl besser nur bei Patienten mit Symptomen testen, schweeeere Frage, kommst Du schon irgendwann drauf, wenn Du lange genug im Internet suchst nach Aussagen, die der vorgefertigten Meinung entspricht.

Tipp : Ich empfehle Prof. Drosten im Handelsblatt zu lesen. Dort hat er diese Frage bereits vor vielen Jahren sehr ausführlich beantwortet und im Übrigen ganz nebenbei, den Käse den Du arme Wurst hier grosskotzig als „Wahrheit“ hingeschmiert hast, komplett widerlegt.

Mir tun die Menschen Leid, die auf anonyme Loser wie Dich reinfallen.

Wenn Du etwas zu melden hättest und auch nur den Hauch einer Ahnung, müsstest Du Dich nicht verstecken, sondern könntest Dich mit Respekt und Anstand in der Sache auseinander setzen und Argumente austauschen, Deine Belege vorlegen und diejenigen, von denen Du hier wahrheitswidrig behauptest, sie würden lügen, sauber und mit besseren Argumenten widerlegen. Dann ist das nämlich auch ein für allemal geklärt und für jeden transparent, keiner würde ihnen mehr folgen.

Warum Du das nicht kannst, soll sich jeder selbst erklären.

In diesem Sinne, Du unterstützt den Zulauf also vielmehr, durch Deine tendenziöse und überhebliche Art, hier anonym herum zu schwurbeln.

Der blanke Neid ist das aus meiner Sicht, ich kann mich irren, ist aber mein Eindruck, offensichtlich überzeugst Du niemanden, außer Dich selbst – und liegst trotzdem falsch.

Armes, einsames, kreischendes Geschöpf.

Beleidigungen, das können doch Querdenker am besten, wie man hier sieht. Sonst nicht viel.

Tut uns nicht Leid, wenn wir dich getriggert haben. War so geplant. Zeigt Euch in all Eurer Pracht!

Wüßtest du wirklich irgendetwas, dann hättest du wenigstens den Plural in der Anrede benutzt (das ist der Fachausdruck für Mehrzahl, nur damit du nicht googeln musst).

Auf welche Professoren beziehst du Nase Dich denn? Auf Eckerts und Bergs „Professor“ Lanka, der kein Professor ist? Auf Hendrick „Storymachine“ Streeck?

Totally lost!

Auf alle beide.
Aber schade – seine/ihre Chance zu argumentieren und auf gepflegten Diskurs hat er/sie sich jetzt verbaut.

Schöner Grundlagenartikel zur Methode! Obwohl ihr euch nicht auf Diskussionen zur Zuverlässigkeit im Einsatz einlassen wolltet, will ich euch folgenden Beitrag im Ärzteblatt nicht vorenthalten:

https://www.aerzteblatt.de/archiv/214890/PCR-Tests-auf-SARS-CoV-2-Hohe-Sensitivitaet

Hier werden interessante Fakten aus dem Labor beschrieben, die die Argumente von Eckert & Co. noch weiter ad absurdum führen.
Hier die wichtigsten Aussagen:

„[…]Die im Artikel zugrunde gelegte Spezifität von 95 % entspricht nicht der Laborroutine. Ringversuche zeigen, dass die Spezifitäten der verwendeten SARS-CoV-2-PCRs in Deutschland 97–100 % erreichen. Dies beinhaltet auch Spezifitätsanalysen gegenüber anderen humanpathogenen Coronaviren. […]“

„[…] In unserem Zentrum wurden bislang 13 994 SARS-CoV-2-PCRs (365 positiv) an 10.655 Patienten durchgeführt (200 positiv, Prävalenz: 0,18 %). Positive Testergebnisse wurden zusätzlich serologisch verifiziert. Nur 1 von 13.994 Tests war falsch-positiv und wurde mittels Wiederholungstestung korrigiert. Somit gab es keinen einzigen Fall einer unberechtigten Isolation bzw. Quarantäne. […]“

Das beudet:
1. Die Zahl falsch-positiverErgebnisse ist sehr gering und wird durch bei Corona-Leugner (absichtlich?) falsch hochgerechnet!

2. „Serologisch verifiziert“ bedeutet, dass in einem zweiten, unabhänigen Test Antikörper nachgewiesen wurden. Alle PCR-Positive zeigten eine Immunantwort. Sie waren also tatsächlich INFIZIERT!
…Darüber hinaus reduziert ein zweiter Test die falsch-positiv-Rate.

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